Probióticos são definidos como um aditivo microbiano que tem efeito benéfico, capaz de modificar a comunidade microbiana associada ao ambiente e hospedeiro, assegurando melhor uso do alimento, melhor resposta a enfermidades, qualidade de água e seu ambiente (VERSHUERE et. al., 2000). No entanto, a seleção de bactérias para o desenvolvimento de um produto é uma tarefa que requer conhecimento, técnica e responsabilidade. Alguns fatores influenciam diretamente a composição microbiológica dos animais aquáticos, como a pressão seletiva que ocorre dentro do intestino, composição da comunidade microbiana presente no ambiente, dieta, entre outros. Desse modo, a seleção de bactérias deverá modular a microbiota intestinal, mantendo preferencialmente, as características microbiológicas naturais e uma boa diversidade de bactérias benéficas, suprimindo bactérias patogênicas.
Com a intensificação dos sistemas de cultivo, os animais são produzidos em condições ambientais extremas, comprometendo a ambiência, aumentando os níveis de estresse dos animais e tornando-os mais susceptíveis à patógenos oportunistas. A dieta tem proporcionado ganhos importantes quanto ao desempenho produtivo e resistência a doenças. A dieta balanceada tem um papel importante no fornecimento dos nutrientes necessários para o bom desenvolvimento zootécnico dos animais, que em alguns sistemas de produção, dependem totalmente de dietas industrializadas. Além do desempenho zootécnico, as dietas aquícolas buscam um papel funcional, aumentando a resistência a patógenos nos animais sob estresses de cultivo. Os probióticos têm sido utilizados de maneira promissora na prevenção de doenças, modulando o sistema imunológico e a microbiota intestinal dos animais, estimulando a diferenciação de células caliciformes no epitélio intestinal, aumentando a proteção dos animais aos patógenos externos. Em um trabalho realizado com tilápias alimentadas com probiótico contendo Bacillus subtilis e Bacillus cereus var. toyoi além do crescimento no tamanho da vilosidade, houve um aumento, considerável, no número de células caliciformes no epitélio intestinal dos animais que consumiram a dieta com o aditivo (MELLO, 2012).
Tabela 1. Média ± desvio padrão das células caliciformes da camada epitelial (μm) da porção média do intestino de juvenis de tilápias após 80 dias de alimentação (MELLO, 2012).
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Parâmetro |
Controle |
Tratado |
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Número de células caliciformes |
220,62 ± 18,50 |
521,88 ± 45,72 |
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Número de vilos |
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6,41 ± 0,5 |
5,37 ± 0,49 |
Figura 1 - . Fotomicrografias da camada epitelial das vilosidades da porção média do intestino de juvenis de Tilápias, mostrando as células caliciformes. A: tratamento controle; B: tratamento com aditivo probiótico mostrando maior marcação das células caliciformes. Células caliciformes (setas). Coloração: PAS. Obj. 20x (MELLO, 2012).
Os resultados sugeriram que a dieta com aditivo probiótico interferiu significativamente na integridade da vilosidade, aumentando a altura, altura total e largura dos vilos, assim como na espessura das células epiteliais de revestimento e número de células caliciformes da mucosa intestinal. Promovendo assim, uma maior proteção contra agentes patogênicos externos.
Seleção de cepas
Antes do processo de produção de probióticos, é importante que as cepas tenham algumas propriedades desejáveis como qualidade na industrialização; cepas capazes de promover efeitos benéficos (como melhor eficiência alimentar e maior resistência a doenças); não serem patogênicas; serem resistentes a pH baixo e ácidos orgânicos e que sejam viáveis por longos períodos, nas condições normais de estocagem. Os micro-organismos selecionados são armazenados em bancos de dados biológicos preservando e mantendo as características genéticas das bactérias. Além disso, é importante verificar se as cepas selecionadas apresentam característica antagônicas às bactérias patogênicas, com importância para aquicultura. As bactérias probióticas possuem a capacidade de sintetizar compostos bacteriostáticos e bactericidas que paralisam e matam bactérias patogênicas. Essa avaliação pode ser feita através de um antibiograma, procedimento onde os inóculos contendo as bactérias probióticas são incubados em placas com bactérias patogênicas, para avaliar se há a produção de compostos inibitórios.
Figura 2. A – Cepa probiótica, após o período de incubação em disco com Ágar BHI. B, delimitado com auxílio de ponteira estéril. C – Cepa em alça de semeadura estéril. D – Placa com meio contendo bactéria patogênica, após a inserção dos discos com probióticos.
Depois da inoculação, as placas são incubadas. A resposta de inibição pode ter tempos diferentes, de acordo com cada bactéria patogênica, portanto o avaliador deverá monitorar cada teste. O halo de inibição criado deve ser medido em milímetros.
Tabela 2. Diâmetros dos halos de inibição observados sobre cultivos de bactérias patogênicas para peixes de águas quentes, peixes de águas frias e camarões desafiados com cepas probióticas da IMEVE.
Figura 3. Halo de inibição do produto LACPRO frente as bactérias Piscirickettsia salmonis EM-90 (superior) e Piscirickettsia salmonis LF-89 (inferior) incubadas por 72 horas. Bactérias patogênicas para salmonídeos.
Após atender aos critérios de seleção e à resposta frente a bactérias patogênicas, os probióticos passam pelo processo de industrialização. Esse processo é tão importante quanto os demais, pois o sucesso na utilização do probiótico também está relacionado à maneira de fabricação, garantindo um produto de qualidade para o cliente final.
Produção de probióticos
São utilizados diversos grupos de micro-organismos para a produção dos aditivos probióticos. Dentre as bactérias utilizadas pela IMEVE estão as bactérias intestinais Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus acidophilus e Enterococcus faecium e os bacilos, Bacillus cereus var. toyoi, Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis.
Figura 2. Bactéria intestinal Enterococcus faecium do acervo de bactérias da IMEVE.
Para os micro-organismos liofilizados é necessário o cultivo individual de cada cepa microbiana em meios de cultura, condições atmosféricas e temperaturas específicas. As cepas matrizes devem ser semeadas tomando-se o cuidado de observar, antes da semeadura, a sua pureza. A partir das cepas matrizes, inicia-se a multiplicação dos micro-organismos para posterior inoculação nos biorreatores, essa fase de produção é denominada pré-inoculação. Após a pré-inoculação, o conteúdo é transferido para o biorreator onde acontece o processo de multiplicação até a obtenção de crescimento adequado. Em seguida, é realizada a concentração do multiplicado em sistema específico de filtração, para que a quantidade de micro-organismos por mililitro possa ser elevada e a concentração do produto potencializada. Após a obtenção da massa microbiana, coloca-se o veículo para o congelamento e posterior liofilização. A liofilização consiste na retirada da água intracelular dos micro-organismos congelados por sublimação, evitando a formação de cristais de gelo, capazes de provocar danos às estruturas celulares.
Após o processo de liofilização, os micro-organismos são envasados e armazenados em temperatura adequada. Durante o processo produtivo é necessário a retirada de amostras para se avaliar a qualidade da multiplicação microbiana. As medidas adotadas dentro do controle de qualidade incluem a confirmação da pureza, através de coloração de Gram e semeadura em meios seletivos para os diferentes micro-organismos e observação da morfologia de suas colônias.
A complexidade dos processos para a produção de um aditivo probiótico deve ser resumida em um produto de alta qualidade, capaz de melhorar o desempenho na produção animal e contribuir para a saúde do plantel. Todavia o produtor deve entender que as biotecnologias empregadas no sistema de produção são ferramentas importantes para que se possa aumentar a produtividade, no entanto, em hipótese alguma, a utilização de aditivos profiláticos irá isentar o produtor de manter o monitoramento constante dos animais, adotar medidas sanitárias e manejos adequados para o cultivo.
Autores:
Dr. Renato de Almeida
Gerente da linha de Aquicultura IMEVE S.A.
Jean Carlos Alves
Gerente industrial – IMEVE S.A.
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